孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠

doi:10.12307/2021.005

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (25): 3962-3969.doi: 10.12307/2021.005

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠

孙建威1，杨新明2，张瑛2

1河北北方学院研究生学院，河北省张家口市 075000；2河北北方学院附属第一医院骨科，河北省张家口市 075000

收稿日期:2020-07-06 修回日期:2020-07-09 接受日期:2020-08-04 出版日期:2021-09-08 发布日期:2021-03-24
通讯作者: 杨新明，主任医师，河北北方学院附属第一医院骨科，河北省张家口市 075000
作者简介:孙建威，男，1987年生，河北省邯郸市人，汉族，河北北方学院在读硕士，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
河北省卫生厅2011 年医学科学研究重点项目计划(20110176)，项目负责人：杨新明；2013 年度河北北方学院创新人才培育基金项目(CXRC1322)，项目负责人：杨新明

Effect of montelukast combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on spinal cord injury in rat models

Sun Jianwei1, Yang Xinming2, Zhang Ying2

1Graduate School of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China; 2Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China

Received:2020-07-06 Revised:2020-07-09 Accepted:2020-08-04 Online:2021-09-08 Published:2021-03-24
Contact: Yang Xinming, Chief physician, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
About author:Sun Jianwei, Master candidate, Graduate School of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by:
Medical Science Research Key Project of Hebei Provincial Department of Health in 2011, No. 20110176 (to YXM); Innovative Talent Cultivation Foundation of Hebei North University in 2013, No. CXRC1322 (to YXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
孟鲁司特：作为一种新型的非激素类抗炎药物，能够通过特异性地选择半胱氨酰白三烯(CysLT1)受体，抑制其与白三烯结合，从而抑制白三烯受体介导的炎症反应，在临床常用于治疗哮喘等疾病。最新动物实验研究证实，大鼠脊髓损伤早期使用孟鲁司特能够显著改善继发性炎性反应，有利于脊髓功能恢复。
骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的机制：将骨髓间充质干细胞移植到受损的脊髓节段不仅可以长期存活，同时为神经元和胶质细胞的分化起到一种“网架”的作用，促进神经轴突生长，同时骨髓间充质干细胞有利于脊髓损伤部位微环境的改善，迁移至损伤部位的骨髓间充质干细胞可以自分泌和(或)旁分泌脑源性神经营养因子、神经生长因子等多种神经保护因子，这些营养因子表达上调，改善局部微血管再生、重构，修复损伤细胞。

背景：联合多种治疗手段能够针对不同靶点进行有效干预，发挥协同或叠加效应，已成为当今临床治疗脊髓损伤的新理念。
目的：探讨孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的作用。
方法：60只8周龄健康雄性SD大鼠随机分为4组，每组15只，分别为模型组、孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组、联合组。各组均按照Allen法进行脊髓损伤造模，在造模成功后1，6 h，通过灌胃给予孟鲁司特5 mg/kg或等量生理盐水，之后1次/d，连用30 d，造模后2 h在脊髓损伤区域一次性注入1 μL BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液或等量PBS。造模后1，3，7，14，21，30 d，应用BBB评分和Rivlin斜板实验进行大鼠后肢运动功能评价；造模后7 d，采用苏木精-伊红染色和Nissl染色观察大鼠脊髓组织病理学变化；采用免疫组化法检测大鼠脊髓组织胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β的表达以及BrdU阳性标记率；采用Western blot法检测大鼠脊髓组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。
结果与结论：①造模后7，14，21，30 d，联合组、孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组BBB评分和Rivlin斜板实验结果明显好于模型组
(P < 0.05)；②造模后7 d，联合组、孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组炎性反应及水肿减轻，损伤空洞面积和胶质瘢痕面积减小，损害节段结构改善；③造模后7 d，联合组、孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β表达明显低于模型组(P < 0.05)，联合组BrdU阳性率高于骨髓间充质干细胞组(P=0.000)；④造模后7 d，联合组、孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组Bax和Caspase-3的表达显著低于模型组(P < 0.05)，Bcl-2的表达显著高于模型组(P < 0.05)；⑤联合组上述所有指标均优于孟鲁司特组、骨髓间充质干细胞组；⑥结果表明，孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植能够显著改善脊髓损伤大鼠神经运动功能，其机制可能与抑制局部炎性反应及胶质细胞增生、减少凋亡相关蛋白的表达、提高骨髓间充质干细胞移植成活率有关。

https://orcid.org/0000-0002-9019-0631(孙建威)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 脊髓损伤, 孟鲁司特, 胶质纤维酸性蛋白, 白细胞介素1β, BrdU染色

Abstract: BACKGROUND: Combination with a variety of treatment methods can effectively intervene for different targets, play a synergistic or superimposed effect, and has become a new concept of clinical treatment of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of montelukast combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the recovery of neurological function in rats with spinal cord injury.
METHODS: Sixty 8-week-old healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups, each with 15 rats, namely model group, montelukast group, bone marrow mesenchymal stem cell group, and combination group. The spinal cord injury model was performed in each group according to the Allen method, and montelukast 5 mg/kg or the equivalent amount of normal saline was administered by gavage at 1 and 6 hours after the model was successfully established, and then once a day for 30 days. At 2 hours after modeling, 1 μL of BrdU-labeled bone marrow mesenchymal stem cell suspension or an equivalent amount of PBS was injected into the spinal cord injury area at a time. At 1, 3, 7, 14, 21, and 30 days after modeling, the BBB score and Rivlin inclined plate test were used to evaluate the motor function of the rat’s hind limbs. At 7 days after modeling, the histopathological changes of spinal cord were observed by hematoxylin-eosin staining and Nissl staining. Immunohistochemical method was applied to detect the expression of glial fibrillary acidic protein, interleukin-1β and BrdU positive labeling rate in rat spinal cord tissue. Western blot assay was used to detect the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax and Caspase-3 in rat spinal cord tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 7, 14, 21, and 30 days after modeling, the BBB score and Rivlin inclined plate test results of the combination group, montelukast group and bone marrow mesenchymal stem cell group were significantly higher than those of the model group (P < 0.05). (2) At 7 days, , the inflammatory reaction and edema were reduced; the area of injury cavity and glial scar was reduced; and the structure of damaged segment was improved in combination group, montelukast group and bone marrow mesenchymal stem cell group. (3) At 7 days, the expressions of glial fibrillary acidic protein and interleukin-1β in combination group, montelukast group and bone marrow mesenchymal stem cell group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). The positive rate of BrdU in combination group was higher than that in bone marrow mesenchymal stem cell group (P=0.000). (4) At 7 days, the expression levels of Bax and Caspase-3 in combination group, montelukast group and bone marrow mesenchymal stem cell group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05); the expression of Bcl-2 was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). (5) All the above indexes in combination group were better than those in montelukast group and bone marrow mesenchymal stem cell group. (6) The results show that montelukast combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation can significantly improve the neuromotor function of rats after spinal cord injury. The mechanism may be related to inhibiting local inflammatory response and glial cell proliferation, reducing the expression of apoptosis-related proteins, and increasing the survival rate of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, spinal cord injury, montelukast, glial fibrillary acidic protein, interleukin-1β, BrdU staining

中图分类号:

孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.

Sun Jianwei, Yang Xinming, Zhang Ying. Effect of montelukast combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on spinal cord injury in rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(25): 3962-3969.

图/表（结果） 8

2.1 BMSCs的形态倒置相差显微镜下原代细胞呈类圆形，分布欠均匀，第3代BMSCs在培养第7天可见细胞呈梭形聚集，集落大小不一，第14天可见分布更加均匀有序的梭形细胞，见图1。经流式细胞仪测定BMSCs表面特异性标志物CD29、CD34、CD44、CD45的阳性率分别为97.6%，2.4%，92.5%，0.95%。
2.2 实验动物数量分析 SD大鼠造模后2 h开始恢复意识状态，8 h完全恢复清醒，表现为前肢可活动，双下肢基本瘫痪，剔除3只不合格大鼠，重新补齐数量进行造模，最终60只SD大鼠均进入结果分析。

2.3 大鼠后肢运动功能评分各组大鼠术前BBB评分均为21分，脊髓损伤后1，3 d各组BBB评分差异无显著性意义
(P > 0.05)，术后7，14，21，30 d，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组BBB评分均显著高于模型组(P < 0.05)，联合组BBB评分均高于孟鲁司特组和BMSCs组(P < 0.05)，见表1，图2A。各组大鼠术前Rivlin斜板实验均为60°，脊髓损伤后1，3 d各组Rivlin斜板实验结果差异无显著性意义(P > 0.05)，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组Rivlin斜板实验均显著高于模型组(P < 0.05)，联合组Rivlin斜板实验均高于孟鲁司特组和BMSCs组(P < 0.05)，见表2和图2B。分析实验结果得出：孟鲁司特组、BMSCs组、联合组均可显著改善大鼠后肢运动功能，且随着时间的延长，效果逐渐明显，联合组效果优于孟鲁司特组和BMSCs组。

2.4 各组大鼠脊髓组织病理学改变
2.4.1 苏木精-伊红染色结果大鼠造模成功后，模型组可见脊髓灰质出现大量炎性细胞因子浸润，细胞出血、水肿，神经元坏死、凋亡明显。孟鲁司特组、BMSCs组和联合组的大鼠脊髓组织切片可见出血水肿显著减轻，炎性细胞因子浸润显著减少，神经元溶解、凋亡减轻，其中联合组效果更加显著，见图3A。
2.4.2 Nissl染色结果与模型组相比，孟鲁司特组、BMSCs组和联合组运动神经元数量明显增加(P < 0.05)。此外，与孟鲁司特组、BMSCs组相比，联合组运动神经元数量明显增加(P < 0.05) ，见图3B，C。

2.5 免疫组织化学检测胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β的表达造模后7 d，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β的表达明显低于模型组(P < 0.05)，联合组胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β表达明显低于孟鲁司特组、BMSCs组(P < 0.05)，见图4。脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β表达增多，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组均能抑制胶质细胞增生及炎性反应，联合组抑制效果优于孟鲁司特组、BMSCs组。

2.6 BrdU单染结果造模后7 d，BMSCs组和联合组脊髓损伤节段可见阳性细胞(细胞核呈棕褐色)，BMSCs组BrdU阳性率(6.51±0.82)%显著低于联合组(8.71±0.64)%(P=0.000)，表明孟鲁司特有助于提高BMSCs局部移植成活率，促进BMSCs发挥作用，见图5。

2.7 Western blot法检测大鼠脊髓组织中凋亡蛋白表达造模后7 d，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组大鼠Bcl-2的表达较模型组显著增加(P < 0.05)，Bax和Caspase-3的表达较模型组显著减少(P < 0.05)，联合组治疗效果较孟鲁司特组和BMSCs组更加显著(P < 0.05)，见图6。

参考文献

[1] QU S, MENG HL, LIANG ZG, et al. Comparison of Short-Course Radiotherapy Versus Long-Course Radiotherapy for Treatment of Metastatic Spinal Cord Compression: A Systematic Review and Meta-Analysis. Medicine (Baltimore). 2015;94(43):e1843.
[2] LI Z, CHEN L, LI B, et al. Efficacy and Safety of Surgical Interventions for Treating Multilevel Cervical Spondylotic Myelopathy via Anterior Approach: A Network Meta-Analysis. Pain Physician. 2019;22(4): E275-E286.
[3] MA JK, WEST CR, MARTIN GINIS KA. The Effects of a Patient and Provider Co-Developed, Behavioral Physical Activity Intervention on Physical Activity, Psychosocial Predictors, and Fitness in Individuals with Spinal Cord Injury: A Randomized Controlled Trial. Sports Med. 2019;49(7):1117-1131.
[4] SHENDE P, SUBEDI M. Pathophysiology, mechanisms and applications of mesenchymal stem cells for the treatment of spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 2017;91:693-706.
[5] YAGURA K, OHTAKI H, TSUMURAYA T, et al. The enhancement of CCL2 and CCL5 by human bone marrow-derived mesenchymal stem/stromal cells might contribute to inflammatory suppression and axonal extension after spinal cord injury. PLoS One. 2020;15(3):e0230080.
[6] LIU W, WANG Y, GONG F, et al. Exosomes Derived from Bone Mesenchymal Stem Cells Repair Traumatic Spinal Cord Injury by Suppressing the Activation of A1 Neurotoxic Reactive Astrocytes. J Neurotrauma. 2019;36(3):469-484.
[7] SATTI HS, WAHEED A, AHMED P, et al. Autologous mesenchymal stromal cell transplantation for spinal cord injury: A Phase I pilot study. Cytotherapy. 2016;18(4):518-522.
[8] KORKMAZ K, GEDIK HS, BUDAK AB, et al. Effect of Montelukast on Spinal Cord Ischemia- Reperfusion Injury. Turk Neurosurg. 2015;25(5): 757-765.
[9] GELOSA P, BONFANTI E, CASTIGLIONI L, et al. Improvement of fiber connectivity and functional recovery after stroke by montelukast, an available and safe anti-asthmatic drug. Pharmacol Res. 2019;142: 223-236.
[10] CAVUS G, ALTAS M, ARAS M, et al. Effects of montelukast and methylprednisolone on experimental spinal cord injury in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014;18(12):1770-1777.
[11] COURTINE G, SOFRONIEW MV. Spinal cord repair: advances in biology and technology. Nat Med. 2019;25(6):898-908.
[12] ORR MB, GENSEL JC. Spinal Cord Injury Scarring and Inflammation: Therapies Targeting Glial and Inflammatory Responses. Neurotherapeutics. 2018;15(3):541-553.
[13] GAUDET AD, FONKEN LK. Glial Cells Shape Pathology and Repair After Spinal Cord Injury. Neurotherapeutics. 2018;15(3):554-577.
[14] LIN L, LIN H, BAI S, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) improved functional recovery of spinal cord injury partly by promoting axonal regeneration. Neurochem Int. 2018;115:80-84.
[15] LI D, ZHANG P, YAO X, et al. Exosomes Derived From miR-133b-Modified Mesenchymal Stem Cells Promote Recovery After Spinal Cord Injury. Front Neurosci. 2018;12:845.
[16] LI C, JIAO G, WU W, et al. Exosomes from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Inhibit Neuronal Apoptosis and Promote Motor Function Recovery via the Wnt/β-catenin Signaling Pathway. Cell Transplant. 2019;28(11):1373-1383.
[17] SHAO A, TU S, LU J, et al. Crosstalk between stem cell and spinal cord injury: pathophysiology and treatment strategies. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):238.
[18] HA XQ, YANG B, HOU HJ, et al. Protective effect of rhodioloside and bone marrow mesenchymal stem cells infected with HIF-1-expressing adenovirus on acute spinal cord injury. Neural Regen Res. 2020;15(4):690-696.
[19] MANSOUR RM, AHMED MAE, EL-SAHAR AE, et al. Montelukast attenuates rotenone-induced microglial activation/p38 MAPK expression in rats: Possible role of its antioxidant, anti-inflammatory and antiapoptotic effects. Toxicol Appl Pharmacol. 2018;358:76-85.
[20] DAVID S, ZARRUK JG, GHASEMLOU N. Inflammatory pathways in spinal cord injury. Int Rev Neurobiol. 2012;106:127-152.
[21] HE Z, ZANG H, ZHU L, et al. An anti-inflammatory peptide and brain-derived neurotrophic factor-modified hyaluronan-methylcellulose hydrogel promotes nerve regeneration in rats with spinal cord injury. Int J Nanomedicine. 2019;14:721-732.
[22] LI Z, WU F, XU D, et al. Inhibition of TREM1 reduces inflammation and oxidative stress after spinal cord injury (SCI) associated with HO-1 expressions. Biomed Pharmacother. 2019;109:2014-2021.
[23] CASHA S, RICE T, STIRLING DP, et al. Cerebrospinal Fluid Biomarkers in Human Spinal Cord Injury from a Phase II Minocycline Trial. J Neurotrauma. 2018;35(16):1918-1928.
[24] WANG C, SHI D, SONG X, et al. Calpain inhibitor attenuates ER stress-induced apoptosis in injured spinal cord after bone mesenchymal stem cells transplantation. Neurochem Int. 2016;97:15-25.
[25] LI C, CHEN X, QIAO S, et al. Effects of Wharton’s jelly cells of the human umbilical cord on acute spinal cord injury in rats, and expression of interleukin-1β and nerve growth factor in spinal cord tissues. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2016;44(5):1254-1258.
[26] BRADBURY EJ, BURNSIDE ER. Moving beyond the glial scar for spinal cord repair. Nat Commun. 2019;10(1):3879.
[27] HUANG X, KIM JM, KONG TH, et al. GM-CSF inhibits glial scar formation and shows long-term protective effect after spinal cord injury. J Neurol Sci. 2009;277(1-2):87-97.
[28] DU XJ, CHEN YX, ZHENG ZC, et al. Neural stem cell transplantation inhibits glial cell proliferation and P2X receptor-mediated neuropathic pain in spinal cord injury rats. Neural Regen Res. 2019;14(5):876-885.
[29] LI Z, LIU F, HE X, et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells attenuate inflammation and demyelination of the central nervous system in EAE rats by regulating the polarization of microglia. Int Immunopharmacol. 2019;67:268-280.
[30] OKADA S, HARA M, KOBAYAKAWA K, et al. Astrocyte reactivity and astrogliosis after spinal cord injury. Neurosci Res. 2018;126:39-43.
[31] JAIMES Y, NAALDIJK Y, WENK K, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Microvesicles Modulate Lipopolysaccharides-Induced Inflammatory Responses to Microglia Cells. Stem Cells. 2017;35(3):812-823.
[32] 杨新明,成垚昱,张振梁,等.甲强龙在骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤中的作用及对肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β表达的影响[J].中国医学科学院学报,2017,39(5):615-622.
[33] GAO J, SUN Z, XIAO Z, et al. Dexmedetomidine modulates neuroinflammation and improves outcome via alpha2-adrenergic receptor signaling after rat spinal cord injury. Br J Anaesth. 2019; 123(6):827-838.
[34] KEEFE KM, SHEIKH IS, SMITH GM. Targeting Neurotrophins to Specific Populations of Neurons: NGF, BDNF, and NT-3 and Their Relevance for Treatment of Spinal Cord Injury. Int J Mol Sci. 2017;18(3):548.
[35] GAO K, SHEN Z, YUAN Y, et al. Simvastatin inhibits neural cell apoptosis and promotes locomotor recovery via activation of Wnt/β-catenin signaling pathway after spinal cord injury. J Neurochem. 2016;138(1):139-149.
[36] FU XM, WANG Y, FU WL, et al. The Combination of Adipose-derived Schwann-like Cells and Acellular Nerve Allografts Promotes Sciatic Nerve Regeneration and Repair through the JAK2/STAT3 Signaling Pathway in Rats. Neuroscience. 2019;422:134-145.
[37] 杨拯,邱有波,包旭,等.孟鲁司特对大鼠脊髓损伤保护作用的研究[J].重庆医学,2012,41(31):3291-3294,3297.
[38] HERRMANN JE, IMURA T, SONG B, et al. STAT3 is a critical regulator of astrogliosis and scar formation after spinal cord injury. J Neurosci. 2008;28(28):7231-7243.
[39] TAMURA M, NAKAMURA M, OGAWA Y, et al. Targeted expression of anti-apoptotic protein p35 in oligodendrocytes reduces delayed demyelination and functional impairment after spinal cord injury. Glia. 2005;51(4):312-321.
[40] GENOVESE T, ROSSI A, MAZZON E, et al. Effects of zileuton and montelukast in mouse experimental spinal cord injury. Br J Pharmacol. 2008;153(3):568-582.
[41] ZHOU C, SHI X, HUANG H, et al. Montelukast attenuates neuropathic pain through inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappa B in a rat model of chronic constriction injury. Anesth Analg. 2014;118(5):1090-1096.
[42] VAQUERO J, ZURITA M, RICO MA, et al. Intrathecal administration of autologous mesenchymal stromal cells for spinal cord injury: Safety and efficacy of the 100/3 guideline. Cytotherapy. 2018;20(6):806-819.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9至12月在河北北方学院生命科学中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级4周龄SD大鼠2只，体质量分别为100，110 g；SPF级3月龄SD健康雄性大鼠60只，体质量为(280±20) g，均购自中国医学科学院动物研究所，动物许可证号：SCXK (京) 2019-0008。饲养环境湿度42%-46%，温度21-26 ℃，光照12 h阴暗12 h，实验方案经河北北方学院动物实验伦理委员会批准(批准号：2020213)。
1.3.2 实验试剂与仪器 iCell-0004 DMEM培养基(赛百康有限公司)；胎牛血清(美国 Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Amresco公司)；PE标记的CD29、CD34、CD45、CD90大鼠抗体(美国BO公司)、大鼠BrdU ELISA试剂盒(美国Sigma公司)；DAB 显色系统、PBS溶液、SABC试剂盒(福州迈新)；抗兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白抗体、抗鼠白细胞介素1β抗体(上海雅吉生物)；孟鲁司特(鲁南贝特制药)；倒置相差显微镜(重庆光学)；全自动组织脱水机、石蜡切片机、组织包埋机(美国莱卡公司)；流式细胞仪(美国Bioscience公司)；TGL-16G离心机(上海安亭)；电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；Image-Pro PLUS图像分析软件(美国Meyer Instruments 公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs 培养、鉴定、BrdU标记 4周龄SD大鼠2只，麻醉后处死，在体积分数为70%乙醇中浸泡10 min后，取出两侧股骨及胫骨，暴露骨髓腔，使用30 mL DMEM培养液冲洗骨髓腔，将原代细胞接种于培养皿中，吹打均匀，使用离心机离心(1 000 r/min离心5 min)，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中进行培养，在培养3 d时更换培养液，之后每2 d换液1次，每日观察细胞的生长情况，待贴壁细胞将近80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶3比例进行传代培养。使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。取出生长状态良好的第3，4代BMSCs，待细胞融合达80%以上时，弃培养液，PBS清洗，加入BrdU溶液(3 mg/L)

继续培养2 d，调整细胞浓度为1.5×1011 L-1，流式鉴定细胞表面抗原CD34、CD45阳性率< 2%，CD29、CD90阳性率> 90%。

1.4.2 动物模型制备评价各大鼠的运动功能，确认无异常后，术前禁食水12 h，使用1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，取俯卧位，将大鼠固定于手术台上，T9节段背部去毛后，使用聚维酮碘进行术区消毒，切开皮肤及皮下组织，应用咬骨钳去除相应节段棘突、椎板，暴露脊髓，使用Allen法进行造模，以自制10 g重物以5 cm高处自由落体击中覆盖在脊髓表面的垫片。
造模成功标志：大鼠即刻出现一过性鼠尾连续性抽动和后肢持续性痉挛，逐渐形成迟缓性瘫痪，T9区域发生血肿，表面呈淤紫色。术后使用无菌明胶海绵填塞术区，缝合切口，放回笼中饲养。各组大鼠均在脊髓损伤后1 h内，经腹腔注射青霉素(20万U/kg)，2次/d，持续3 d，以预防切口感染。每天按摩膀胱人工排尿2次，确保实验大鼠存活率。
1.4.3 分组及处理取8周龄SPF级健康雄性SD大鼠60只随机分为4组，每组15只，分别为模型组、孟鲁司特组、BMSCs组、联合组。①模型组：在造模成功后1，6 h，通过灌胃给予等量的生理盐水，之后1次/d，连用30 d；造模成功后2 h在脊髓损伤中线上、下各0.5 cm处(注入深度
1.5 mm)使用微泵以5 μL/min均速一次性注入1 μL PBS；②孟鲁司特组：在造模成功后1，6 h，通过灌胃给予孟鲁司特5 mg/kg，之后1次/d，连用30 d；造模成功后2 h在脊髓损伤中线上、下各0.5 cm处(注入深度1.5 mm)使用微泵以
5 μL/min均速一次性注入1 μL PBS；③BMSCs组：在造模成功后1，6 h，通过灌胃给予等量的生理盐水，之后1次/d，连用30 d；造模成功后2 h在脊髓损伤中线上、下各0.5 cm处(注入深度1.5 mm)使用微泵以5 μL/min均速一次性注入1 μL BMSCs悬液(含1.5×105个细胞)；④联合组：在造模成功后1，6 h，通过灌胃给予孟鲁司特5 mg/kg，之后1次/d，连用30 d；造模成功后2 h在脊髓损伤中心区域(注入深度1.5 mm)使用微泵以5 μL/min均速一次性注入1 μL BMSCs(含1.5×105个细胞)。
1.4.4 大鼠后肢运动功能评分造模后1，3，7，14，21，30 d，各组分别随机选取6只大鼠，进行BBB评分和Rivlin斜板实验。BBB评分范围为0-21分，0分表示瘫痪，无自主后肢运动功能，21分为后肢神经运动正常，大鼠双后肢运动功能包括躯干位置、步态协调性及爪的置放等。Rivlin斜板实验指将各组大鼠放于平坦、不光滑的斜板上，斜板由0°缓慢上升，每次升高5°，直至大鼠能够在原有位置至少坚持5 s而不从斜板上跌落，使用量角器测量斜板角数。采用双盲、双人独立完成评价，每只大鼠重复测试3次，最终结果取平均值。
1.4.5 取材造模后7 d，完成BBB评分和Rivlin斜板实验后，各组随机选取6只大鼠，行过量麻醉，剖胸，进行左心室至主动脉插管，40 g/L多聚甲醛固定，取出损伤节段脊髓组织约1 cm，将获取的脊髓组织分为2份，一份制备切片，进行组织学观察，一份进行Western blot检测。在4 ℃条件下，将用于进行组织学观察的标本置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，经过乙醇梯度脱水、石蜡包埋后，每只大鼠制成30张厚度为5 μm的连续性切片，随机分为5组(每组6张)，以组为单位分别进行苏木精-伊红染色、Nissl染色、BrdU染色以及胶质纤维酸性蛋白和白细胞介素1β免疫组化染色。
1.4.6 苏木精-伊红染色和Nissl染色
(1)苏木精-伊红染色：切片经过脱石蜡和再水化后，避光条件下使用苏木精溶液染色6 min，在1%酸性乙醇中浸泡几秒钟，使用蒸馏水漂洗10 min，加入伊红溶液染色5 min，
然后使用乙醇分级脱水，载玻片用中性香脂密封，并在显微镜下拍摄，完成图像采集。
(2)Nissl染色：切片经过二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后，使用Nissl染色液染色5 min，中性香脂固定。显微镜下观察凋亡神经元缩小或有空泡，正常神经元胞体相对较大，胞体完整，胞核圆而大，使用Image Pro Plus软件统计正常神经元数目。
1.4.7 胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β免疫组化染色应用生物素二步法完成胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β免疫组织化学染色，使用二甲苯对各组织切片完成脱蜡、乙醇水化，使用体积分数3% H2O2对内源性过氧化物酶进行封闭，加入胶质纤维酸性蛋白抗体(1∶200)或白细胞介素1β抗体(1∶100)，放置于37 ℃恒温箱中1 h，加入兔抗二抗在37 ℃
恒温箱中50 min，最后加入显色剂DAB-H2O2，室温下反应15 min后0.01 mmol/L PBS漂洗，使用苏木精复染，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，树胶封固，高倍镜(×400)进行观察，细胞质染成棕褐色为阳性细胞，应用Image-Pro Plus软件进行图像分析。染色强度评分标准：阴性或者弱染色为1分，中度染色为2分，强阳性染色为3分；阳性细胞百分比评分标准：阳性百分比< 10%为1分，10%-50%为2分，> 50%为3分。免疫组化染色评分=染色强度评分×阳性细胞百分比评分。每张切片重复评分3次，结果取平均值。
1.4.8 BrdU染色按照BrdU试剂盒说明书对各组标本切片进行染色，在高倍镜下进行观察，阳性细胞的细胞质被染成棕黄色，统计BMSCs组和联合组BrdU阳性细胞数，计算BrdU阳性率。
1.4.9 Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达取已制备好用于进行Western blot检测的脊髓组织，剪碎后制成粉状，使用RIPA完成裂解，离心机(14 000 r/min)离心10 min后，取少量上清液，应用BCA法进行蛋白质定量，完成SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，在20 ℃
环境下使用5%脱脂乳和0.1%TBS封闭膜3 h，加入Bcl-2 (1∶400)、Bax(1∶200)、caspase-3(1∶200)一抗，在4 ℃条件下孵育过夜，加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶3 500)，
在室温孵育1 h，加入ECL溶液完成显影，应用ChemiDoc触摸成像系统对蛋白质进行曝光。以β-actin为内参，目标蛋白与β-actin 比值代表目标蛋白的相对表达量。使用Chemi Doc XR+凝胶成像系统扫描图像，Image Lab程序进行条带分析。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脊髓损伤后运动功能评分；②各组大鼠脊髓组织病理学改变；③各组大鼠脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素1β的表达；④BMSCs组和联合组脊髓损伤节段BrdU阳性率；⑤各组大鼠脊髓组织中凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。
1.6 统计学分析应用SPSS 24.0对数据进行分析。实验结果均用x±s表示，两组组间比较应用t检验；多组组间比较应用Fisher’s LSD单因素方差分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤常可引起严重的感觉和运动功能障碍，导致受损平面以下完全的感觉、运动功能丧失和尿便失禁，为个人和社会带来沉重的负担[11-13]。当前临床治疗脊髓损伤主要包括药物、手术减压、康复理疗等方法，但均未取得令人满意的效果。BMSCs具有很强的抗凋亡、抗炎等特性，可以通过神经保护、神经再生和再髓鞘化重建脊髓功能，且在特定条件下可分化为神经细胞，具有广阔的发展前景[14-16]，但进一步研究发现，单纯进行BMSCs移植治疗效果较局限，联合其他治疗方式能够显著提高BMSCs移植治疗效果[17-18]。孟鲁司特是一种选择性CysLT1受体拮抗剂，临床常用于治疗支气管哮喘，它通过干扰NADPH氧化酶的活性，抑制超氧化物产生，具有明显的抗炎及抗氧化作用，发挥神经保护效应[19]。
白细胞介素1家族在炎性反应中起关键作用，包括白细胞介素1α和白细胞介素1β，通过与白细胞介素1受体结合而发挥炎性作用。研究表明，白细胞介素1β在脊髓损伤疾病的发生和发展中具有重要作用。在脊髓损伤早期，局部脊髓组织中白细胞介素1β水平迅速升高，且白细胞介素1β表达早于炎性细胞浸润，是诱导神经元发生凋亡的主要原因之一[20-22]。CASHA等[23]研究发现，白细胞介素1β不仅在胶质增生和炎症反应中发挥作用，而且在不同阶段胶质细胞发生再髓鞘化中起重要作用。此次实验结果显示，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组均能够显著降低白细胞介素1β表达水平，且联合组的效果优于孟鲁司特组、BMSCs组。结合BBB评分和Rivlin斜板实验结果可知，降低白细胞介素1β表达后，有助于大鼠脊髓损伤后神经功能恢复，且随着时间的延长，效果逐渐明显，联合组治疗效果更加明显。最新实验研究发现，抑制脊髓损伤后的炎性反应，能够改善局部微环境，有利于BMSCs的存活和神经突触的生长[24-25]。此次实验结果表明，联合组BrdU阳性细胞在移植区域内有效存活数量显著多于BMSCs组，说明孟鲁司特有利于促进BMSCs增殖，提升BMSCs移植存活率。
在中枢神经系统中，胶质细胞活化程度在脊髓损伤的发病机制中发挥着重要作用。胶质细胞在脊髓组织中具有双重作用，胶质细胞的激活是脊髓继发性损伤机制的一个特征，其能提高脊髓抗感染能力和限制损伤区域，然而胶质细胞过度及长时间激活会对脊髓损伤后神经功能恢复造成严重损
害[26-27]，因此，抑制胶质细胞过度活化是一个很有前途的治疗靶点。胶质纤维酸性蛋白是分子质量较小的酸性蛋白质，是构成星形胶质细胞的重要成分[28-29]。脊髓损伤后，星形胶质细胞过度增生，引起胶质纤维酸性蛋白表达上调，胶质纤维酸性蛋白表达水平可间接提示星形胶质细胞活化程度。脊髓损伤后，过度活化的星形胶质细胞增殖并迁移到病变部位，形成胶质瘢痕，是抑制轴突再生和神经功能恢复的重要原
因[30]。GELOSA等[9]发现孟鲁司特可直接降低胶质细胞过度活化，减少神经元的凋亡，同时降低受损脊髓中小胶质细胞的密度，这可能与轴突损伤减少有关。在大鼠脊髓损伤模型中，BMSCs移植能够抑制小胶质细胞活化，减少纤维化瘢痕和胶质瘢痕，同时合成多种神经营养细胞因子，支持和刺激神经元生长，改善动物模型的感觉和运动功能[31]。此次实验结果提示，脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白表达增多，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组均能抑制胶质细胞增生反应，可显著抑制胶质纤维酸性蛋白表达，减少胶质瘢痕形成，有利于脊髓功能恢复，联合组治疗效果优于孟鲁司特组、BMSCs组。
脊髓损伤后的炎性反应、细胞自噬和神经细胞凋亡导致神经元进行性丢失，是引起永久性脊髓功能障碍的重要原因。早期采取有效措施抑制脊髓损伤后继发性损害，能够降低炎性反应和减少神经细胞凋亡，有利于脊髓功能恢复[32-34]。
研究证实，JAK2/STAT3是一条重要的细胞内信号通路，脊髓损伤后强烈的炎性反应使JAK2/STAT3信号通路过度异常激
活[35]，与白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、PRL和CSF等相关受体结合，激活下游酪氨酸残基，如Bax、caspase-3等，从而发生蛋白酶级联反应，诱导神经细胞发生凋亡[36-37]。
STAT3是一种具有关键作用的双功能蛋白，阻断JAK2/STAT3信号通路可明显减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，抑制神经元凋亡[38]。Caspase-3也称为死亡蛋白，是凋亡蛋白家族中最主要的执行蛋白酶之一，细胞凋亡严重程度与Caspase-3含量密切相关。Bax和Caspase-3是促进神经元发生凋亡的主要因子，Bcl-2是抗凋亡蛋白，能够抑制神经元发生凋亡[39]。研究表明，孟鲁司特一种是强效的炎性抑制剂，能够显著减少脊髓损伤后炎性因子的产生，抑制JAK2/STAT3信号通路活化，降低下游Bax、Caspase-3水平，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少细胞凋亡的发生，可改善运动功能障碍[40-41]。VAQUERO等[42]研究结果提示，BMSCs能够抑制胶质细胞中JAK2/STAT3信号通路激活，减少P-STAT3与胶质纤维酸性蛋白结合，抑制胶质纤维酸性蛋白的表达，减轻星形胶质细胞增生和肥大，同时降低炎性因子释放和凋亡蛋白Bax、Caspase-3的产生，从而抑制神经细胞发生凋亡。此次实验结果表明，脊髓损伤后能够导致神经元进行性凋亡，孟鲁司特组、BMSCs组、联合组均能够减少白细胞介素1等炎症因子的产生，从而降低JAK2/STAT3异常激活，促进抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达，使下游Bax、Caspase-3等蛋白的产生降低，抑制神经细胞凋亡，且联合组抑制神经细胞凋亡的效果较孟鲁司特组、BMSCs组更加显著。
综上所述，在脊髓损伤早期使用孟鲁司特，同时进行BMSCs移植，能够显著改善大鼠脊髓损伤后神经运动功能，维护脊髓组织正常形态，减少炎性因子分泌和胶质细胞增生，降低凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进BMSCs存活，二者存在协同或叠加作用。由于实验样本数量较少，实验时间较短，有关参数指标不全面，且孟鲁司特在BMSCs移植中的相关分子作用机制和孟鲁司特是否能够促进BMSCs向神经细胞定向分化仍需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠

Effect of montelukast combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on spinal cord injury in rat models

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[3]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[4]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[5]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.